Проект аспирантуры
- Подробности
- Опубликовано 05.02.2015 11:11
Система сверхчувствительного эпилюминесцентного имиджинга для визуализации наночастиц методом отложенной регистрации
Актуальность и перспективы
Несмотря на стремительное развитие в области микроскопии, отмеченное, в частности Нобелевской премией в 2014 г., в настоящее время существуют серьёзные проблемы, ограничивающие возможность использования традиционных оптических флуоресцентных микроскопов для визуализации биологических объектов. Как известно, большинство флуоресцентных молекул, которые являются составной частью биологических систем или используются как молекулярные зонды для специфического маркирования клеток/ткани, возбуждаются светом ультрафиолетового (УФ) или видимого диапазона и излучают сигнал флуоресценции, в соответствии с законом Стокса, со сдвигом длины волны в длинноволновую область, т.е. в видимом и ближнем инфракрасном спектральных диапазонах. Так, зачастую, в биологических экспериментах выглядят клетки – см. Рисунок 1 – покрашенные так называемыми молекулярными зондами, флуоресцентными красителями, связывающимися с целевыми биомолекулами клетки.
Рисунок 1. Клетки AtT20 с опиоидными рецепторами человека, встроенными в мембрану в результате генно-инженерной процедуры. Ядро и цитоплазма клеток покрашены, соответственно, синим и зелёным флуоресцентными красителями, а мембрана покрашена специально приготовленными флуоресцентными кремнеорганическими наночастицами (неопубликованные результаты)
Часто именно в этом спектральном диапазоне происходит сильное поглощение и рассеивание света биологической тканью, что уменьшает интенсивность возбуждающего излучения. Действительно, трудно себе представить возможность визуализации крохотных наночастиц в роли молекулярных зондов в приповерхностном слое биологической ткани, как это показано на Рисунке 2. Использование ФЛ наноматериалов позволяет решить эту проблему, как это было показано творческим коллективом Лаборатории в серии публикаций (например, регистрация одиночной наночастицы через 1/4-мм крови).
Рисунок 2. Операционное поле в брюшной полости кролика, в котором видна почка
Кроме того, при облучении биологической ткани или клеток возбуждается сигнал аутофлуоресценции, обусловленный флуоресцентными свойствами составляющих биоткани. Хотя разделение сигналов аутофлуоресценции биологической ткани и флуоресцентного маркера осуществляется спектральными методами, эффективность этих методов ограничена, особенно когда оптический имиджинг происходит в приповерхностных слоях сильно светорассеивающей биологической ткани. Всё это существенно снижает оптический контраст изображений маркированных структур на интенсивном фоне аутофлуоресценции биоткани, и, особенно, в случае биоткани/клеток, маркированных другими флуоресцентными красителями.
Предлагаемый метод сверхчувствительной оптической визуализации будет реализован в ходе выполнения проекта путём создания установки и отработки методики биоимиджинга. Метод основан на отложенной регистрации сигнала фотолюминесценции (ФЛ) наночастиц, синтезированных творческим коллективом Лаборатории Оптической Тераностики, например, антистоксовых нанофосфóров (см. Рисунок 3).
Рисунок 3. Микрофотографии спектров синтезированных коллективом проекта фотолюминесцентн
Время послесвечения наших ФЛ наночастиц существенно превышает как время жизни аутофлуоресценции биоткани, обычно измеряемого в наносекундах, так и время распространения фотонов возбуждающего излучения в биоткани, измеряемого в суб-пикосекундах. В основе метода лежит синхронизация заднего фронта импульса возбуждающего излучения с началом фоторегистрации ФЛ сигнала образца. Если установить время задержки фоторегистрации таким образом, чтобы сигнал аутофлуоресценции полностью потух, а сигнал фотолюминесценции потух незначительно, можно добиться значительного улучшения контраста изображений биологических структур, маркированных ФЛ наноматериалами, вплоть до достижения контраста, ограниченного инструментальными шумами фотодетектора. Это открывает очень обещающие возможности, связанные как с визуализацией и длительным отслеживанием молекулярного траффика в клетках, так и оптическим имиджингом патологически-изменённых биологических тканей, маркированных ФЛ наночастицами, на глубине до 1 см.
Предварительное тестирование методики показало, что возможно полностью подавить как собственную аутофлуоресценцию клеток/биоткани, так и оптический фон лазерного возбуждающего излучения (см. Рисунок 4; также см. дрейф одиночных ФЛ нанорубинов в клетке: http://1drv.ms/1xb6Lfv).
Рисунок 4. Оптический имиджинг нанорубинов, введённых в клетки. (Верхняя панель) 3Д псевдоцветовой график, изображающий: (а) аутофлуоресценцию клетки; (b) оптические сигналы от дискретных нанорубинов при запуске системы отложенной регистрации. (Нижняя панель) (с) изображение клетки, окрашенной флуоресцентными молекулярными зондами; (d) оптические сигналы от дискретных нанорубинов при запуске системы отложенной регистрации; (е) наложенные изображения (d) и (е).
